不知不覺地，生物實驗的規(guī)模正在逐漸變小，而通量正在逐漸變大。以往那些龐大的
儀器正被手持設(shè)備或硅制芯片所取代，試劑的單位從毫升轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸蚣{升；而重復數(shù)量也從兩三個變?yōu)?6孔、384孔甚至1536孔。因此，實驗重點也從生物體轉(zhuǎn)換到組織再到
細胞和細胞器，包括細胞核。
從2011年開始，有關(guān)單細胞核測序的論文開始出現(xiàn)。通過谷歌學術(shù)檢索，篇相關(guān)論文是2011年的一項腫瘤進化研究，同年晚些時候還有一篇苔蘚基因靶向分析的研究發(fā)表。2012年，它被用于腫瘤的拷貝數(shù)變異分析。
近兩年，單細胞核測序領(lǐng)域開始迅猛發(fā)展。2018年，僅僅單核RNA-seq（snRNA-seq）就有160多篇論文發(fā)表。這是一種相對較新的方法，分析的是細胞核，而不是完整的細胞。它能夠?qū)﹄y以分離的細胞開展基因表達分析。
snRNA-seq采用微流體技術(shù)，將帶有條形碼的微珠和單個細胞核一起裝入微小的液滴內(nèi)。這些液滴作為納升級的反應管，實現(xiàn)了成千上萬個細胞核分離和建庫，從而大幅降低了建庫的成本。
在有些情況下，細胞是很難完整分離的，比如長期保存的組織，或者大腦細胞和脂肪細胞。在分離細胞時所用的酶和破壞力往往會影響其他細胞區(qū)室的內(nèi)容。此時，單核RNA測序就顯得特別重要。
單核RNA測序有哪些優(yōu)勢？
根據(jù)我們的直覺，處理細胞比處理細胞核要簡單得多。從細胞中獲取細胞核至少需要兩個步驟：裂解和離心。人們通常利用去垢劑裂解細胞，并用Dounce勻漿器均質(zhì)化。之后通過流式細胞儀或梯度離心法純化出細胞核。
然而，單細胞測序的準備過程往往是造成實驗可變性的主要因素。如何獲得足質(zhì)足量的單細胞懸液，這是人們面臨的個難題，特別是那些稀有細胞或難以解離的細胞。
對各種組織而言，細胞外基質(zhì)組分不同，這使得單細胞制備的方式也有所不同。人們需要對細胞解離的操作方案進行個性化的優(yōu)化。
樣品制備過程涉及到組織收集、研磨/均質(zhì)化、酶促解離以及稀有細胞的富集。每一步都可能影響RNA含量，也不能準確地反映細胞類型的真實比例。解離操作往往使樣品偏向于一種或幾種細胞，從而錯過其他更值得關(guān)注的細胞。
于是，科學家和生產(chǎn)商開始引入一些工具和方法，希望盡量減少單細胞研究中的偏倚。加州大學歐文分校的一個研究團隊開發(fā)出一種微流體裝置，這一裝置利用流動限制來產(chǎn)生高剪切力的區(qū)域，從而將細胞與基質(zhì)分離開，使其適用于單細胞分析。美天旎也提供gentleMACS組織處理器及各類組織解離
試劑盒，能夠高效、穩(wěn)定地處理各類樣本，獲得高活力的單細胞懸液。
哪種方法更好：細胞還是細胞核？
人們不禁會問，細胞核轉(zhuǎn)錄組是否代表了整個細胞的轉(zhuǎn)錄組，以及在snRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的基因是否或多或少與特定研究相關(guān)。一些比較單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單核RNA測序的研究表明，轉(zhuǎn)錄本在整個細胞和細胞核中的表達程度相當。
華盛頓大學（圣路易斯）的一個研究小組*近將單細胞測序（DropSeq）與單細胞核測序（sNuc-DropSeq）進行比較。他們研究的對象是纖維化成年小鼠腎臟。通過分析DropSeq獲得的11,000個轉(zhuǎn)錄組，研究人員發(fā)現(xiàn)腎小球細胞不存在，并且另一組細胞似乎經(jīng)歷了解離誘導的應激。相比之下，單核RNA測序揭示了腎細胞的完整多樣性。
這些研究人員的結(jié)論是，盡管在細胞類型覆蓋度方面具有可比性，但單核RNA測序的優(yōu)勢在于“減少了解離偏倚，與冷凍樣品兼容，避免了解離引起的轉(zhuǎn)錄應激反應以及在纖維化腎臟上有著出色的表現(xiàn)”。
單核RNA測序技術(shù)
2017年，Broad研究所張鋒和Aviv Regev領(lǐng)導的團隊開發(fā)出一種名為DroNc-Seq的單細胞核測序方法。它受到Drop-Seq方法的啟發(fā)，融合sNuc-Seq和微流體技術(shù)，能夠?qū)Υ竽X等復雜組織進行大規(guī)模的并行分析。
DroNc-Seq方法消除了解離偏倚的問題，適用于固定組織或不容易解離的細胞。同時，與sNuc-Seq相比，它的實驗規(guī)模大大擴大，可加速表達譜分析，并降低實驗成本。在此基礎(chǔ)上，Dolomite Bio公司開發(fā)出了Nadia高通量單細胞建庫儀。
此外，加州大學圣地亞哥分校的張鹍教授團隊也在2017年開發(fā)出基于微流體的單核RNA測序技術(shù)——snDrop-seq。這種技術(shù)攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA過度降解的難題，可以對成千上萬個單細胞同時進行轉(zhuǎn)錄組分析，還可用來評估新鮮和凍存組織的特異性表達譜，有助于研究組織的功能異質(zhì)性。
單核RNA測序通過揭示復雜腫瘤的細胞類型、狀態(tài)、遺傳多樣性和相互作用，拓寬了單細胞研究的能力，特別是長期保存或冷凍保存的樣品。它克服了解離偏倚的問題，也適用于結(jié)構(gòu)復雜的組織。不過，細胞核的mRNA含量要低得多，而細胞核與細胞RNA表達是否重疊，這也是研究機構(gòu)一直在解決的問題。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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