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細胞培養(yǎng)實驗這三個步驟就能搞定!
閱讀次數:192 發(fā)布時間:2025/5/20 9:43:17
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一、細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中,加入10ml預熱的DMEM完全培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。

加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10mlDMEM完全培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時.去培養(yǎng)基,10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉移至15ml離心管。

加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10mlPBS(經高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進行計數,按照1×106/盤接種,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。

加入lml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(盒內有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內,過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。

凍存液的配制:70%的完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。

進入細胞間開始細胞培養(yǎng)時,必須嚴格按照下列步驟操作:

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒并檢測沒有問題,不確定的溶液和耗材請勿使用,除非特殊情況,不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經卷起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量,需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋,實驗開始可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液,除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗,溶液粘在瓶口,請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍(不要接觸到瓶口)后在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的,必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾,保持工作區(qū)域清潔整齊,后用75%酒精清潔臺面。
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